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豬偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的操作方法
更新日期：
2023-09-19
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病毒DNA的提?。?div>1.取出已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，分別加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃動(dòng)，不要吸到上層保護(hù)液)，用力顛倒10次混勻，12,000rpm離心10min。
2.取500µL上清置于滅菌離心管中，加入500µL異丙醇，混勻，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管，室溫融化，13,000rpm離心15min。
3.棄上清，沿管壁緩緩加入1mL洗滌液，輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上1min，再將離心管真空抽干15min或37℃烘干。
4.用30µL無菌水溶解沉淀，作為模板備用。
樣品制備：
1.樣品采集：病死或撲殺的豬，取大腦海馬背側(cè)皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結(jié)等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血5mL，2～8℃保存。(要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。)
2.樣品處理：
2.1組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
2.2全血樣品的處理：待血凝后取血清放于離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
2.3陽性對(duì)照的處理：混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
2.4陰性對(duì)照的處理：混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
PCR：
1.反應(yīng)體系：分別取16µLPCR反應(yīng)液A(用前混勻)、2µLPCR反應(yīng)液B(用前混勻)和2µL模板DNA，混勻。
2.反應(yīng)程序：在PCR儀上運(yùn)行以下程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
電泳：
1.制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2.電泳：待膠凝固后，取5µLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
3.染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結(jié)果。
